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你了解酶標儀中熒光與化學發光的區別嗎?
加入時間:2024-02-22 16:03:58  當前新聞點擊率:153   標簽:酶標儀 

近年來,酶標儀的功能逐漸增多,應用領域也不斷得到拓展。其中常見的多功能酶標儀為具有光吸收(ABS),熒光強度(FL)和化學發光(LUM)基礎三功能酶標儀,光吸收主要用于檢測OD值,包括Elisa,酶活,酶動力學,OD600等,熒光與化學發光則檢測的是熒光強度。

那熒光與化學發光有什么區別呢,什么實驗該用熒光檢測,什么又該用化學發光檢測呢?

酶標儀

首先,熒光是被激發后,酶標儀檢測發射光的熒光強度,例如,熒光染料Hoechst,PI,Calcien AM等以及熒光報告基因GFP,RFP等;化學發光是指通過化學反應或生物化學反應發出的可見光,與熒光相比不需要激發光,所以具有更低的背景。

熒光原理:熒光是短波長的光激發,電子從基態躍遷至激發態,激發態不穩定,電子需要重新回到基態,這時損失的一部分能量,會以熒光的形式呈現。

熒光檢測原理

熒光檢測原理

化學發光原理:按原理可以分為兩類,其中一類為化學反應發光,常見是魯米諾的反應發光,另外一類為生物化學發光,例如螢火蟲熒光素酶,海腎熒光素酶。

化學發光檢測原理

化學發光檢測原理

下面我們來看一下熒光與化學發光都有哪些應用?

一. 熒光

1. 細胞活力,毒性檢測方法

實驗原理:熒光強度與活細胞數成正比、靈敏度高、特異性好、組合成復合熒光染料使用。例如:根據細胞膜完整性差異,熒光染料(Calcein AM,EthD-III)對活細胞/死細胞的穿透特性不同,對其進行特異性標記,有常規熒光染料也有優化試劑盒。

2. 活細胞中熒光蛋白的表達

熒光蛋白在監測生物體內研究中,起到越來越重要的作用,隨著時間的推移,目前可以使用的熒光蛋白的種類也越來越豐富。他們都可以在眾多細胞和組織中被克隆復制,穩定且毒性小,不需額外輔助也可在體內產生熒光。

例如:GFP報告基因是一種同時編碼GFP和靶標序列的基因, 把GFP的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因,或與其它目的基因相融合,在調控序列控制下進行表達,通過檢測GFP的熒光強弱來標定目的基因的表達調控

二.化學發光

1.  雙熒光素酶報告基因

報告基因一般用來研究真核生物的基因表達,在雙報告基因實驗中,細胞需轉染兩種質粒,一種含有目的基因調控的啟動子,另一種包含一個質控基因的組成型啟動子,將兩個報告基因共轉染,可以更好的減小實驗誤差。

Promega的雙報告基因實驗(DLR)允許使用者在一個微孔板中分別檢測螢火蟲和海腎熒光素酶,其中螢火蟲作為報告基因,海腎作為質控基因,分別進行兩次化學發光讀數。

2. 魯米諾試劑—化學發光

ELISA化學發光夾心法試劑盒QuantiGlo luminescent ELISA (R&D Systems) ,通過化學反應產生熒光,可以用來檢測人類VEGF,內皮素-1,IL-6,IL-8,IL-1,IL-2,TNF-alpha等。

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